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什么是萤光原位杂交技术

萤光原位杂合技术
萤光原位杂合技术(FISH)是一种细胞遗传学技术,可以用来检测基因体上面特定核苷酸序列的存在,亦可藉由检测信使RNA(mRNA)的表现量来观测基因的表现。其基本原理如图一所示:在小片段的DNA探针上以缺口转化法(nick translation)标定Dig-dUTP或Biotin-dUTP,接着取一片经由福马林固定好的组织切片,将带有标定的单股DNA探针与之进行杂合,完成之后使用萤光标定的Anti-Dig/Biotin抗体进行检测。此抗体会专一性结合上样本中已经被Dig/Biotin标记引子杂合的核酸,萤光标定的抗体可在萤光显微镜下被观测萤光

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图解:FISH机制示意图
相比于传统用于检测DNA/RNA存在或表现量的PCR,RT-PCR或real-time PCR等技术,FISH存在以下特色:
1.其检测方式为直接将探针送入固定好的细胞/组织中进行检测,比起将核酸取出的PCR检测方式,FISH除了侦测表现量的变化之外,更能够对目标核酸序列在细胞内或是组织内的分布有视觉性的直接观察。
2.PCR产物需要用胶体电泳的方式观察。引子对间可能的相互干扰或是相似的产物大小会严重影响结果的观察,而使得很难藉由在同一个反应中放入不同的引子对来同时检测不同的产物。然而FISH可以利用不同的萤光蛋白,简单的以颜色来分辨不同的目标序列。
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图解:FLSH技术同时检测五种不同基因产物果:蝇体内的表现分布示意图
3.对比一般PCR需要一定数量的细胞来萃取DNA/RNA进行反应,FISH可以在单个细胞的数量级进行独立的检测,如图三。这在诸如病毒感染、细胞病变或突变等领域的检测及治疗的评估扮演了重要的角色。
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图解:HeLa Cell以不同剂量的siRNA处理,同时以FLSH技术侦测RNA/siRNA的量变化
在此以乳癌HER2基因的检测说明FISH技术在临床应用上的价值,HER2的全文为第二型人类表皮生长因子接受体,是一个在正常细胞中也会表现的基因。但是在癌症细胞中此基因会被过度表现使得细胞表面有过多的生长因子接受体可以接受生长因子的刺激,致使细胞生长与分裂快速,表现出癌细胞的行为。乳癌病患中大约有25~30%为HER2阳性反应,由于其生长快速的特性使得治疗的策略需要特别谨慎的选择。因此HER2基因的检测在乳癌病例中非常的重要,目前的检测方式为免疫组织化学染色法与FISH两阶段的检测方式。由操作快速、不需要萤光显微镜的IHC技术进行初步检测。呈现弱阳性以上反应之检体转由FISH技术进行量化检测,结果交由医师与病患讨论接续之治疗方式。
FISH技术提供了基因表现定量与分布的检测方式,并能以视觉化的方式被观察。结合PCR、IHC、西方墨点法以及凝集反应等检验技术,可以让我们对细胞层级的分子生物学与生物医学研究有更多观察的手段,并有更全面性的了解。

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